HƯỚNG DẪN THỰC HÀNH EAA / EMQN CHO XÉT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ CHẨN ĐOÁN HỘI CHỨNG VI MẤT ĐOẠN NHIỄM SẮC THỂ Y
TÓM TẮT
Xét nghiệm sinh học phân tử hội chứng vi mất đoạn nhiễm sắc thể Y là một xét nghiệm di truyền phổ biến trong việc chẩn đoán bệnh bế tinh Azoospermia và bệnh Oligozoospermia (sự giảm nồng độ của tinh trùng trong dịch tinh dịch) ở nam giới. Từ năm 1999, EAA và EMQN đã tích cực tham gia vào việc hỗ trợ cải thiện chất lượng của các xét nghiệm chẩn đoán bằng cách xuất bản các bản hướng dẫn trong phòng thí nghiệm cho các xét nghiệm sinh học phân tử chẩn đoán vi mất đoạn nhiễm sắc thể Y và cung cấp các thử nghiệm đánh giá chất lượng bên ngoài. Bản sửa đổi hiện tại của hướng dẫn phòng thí nghiệm năm 2004 tóm tắt tất cả các kiến thức lâm sàng liên quan đến nhiễm sắc thể Y (mất đoạn cổ điển, một phần và mất gen đặc hiệu, tương quan kiểu hình kiểu gen, các vấn đề phương pháp) và cung cấp cập nhật về kết quả của chương trình kiểm soát chất lượng. Những khía cạnh này cũng phản ánh sự đồng thuận của nhóm các chuyên gia có mặt tại Hội nghị chuyên đề Florence-Utah gần đây về “Các bệnh di truyền gây vô sinh ở nam giới”. Trong 10 năm qua, mất đoạn gr/gr đã được chứng minh là một yếu tố nguy cơ đáng kể đối với sự suy yếu sản xuất tinh trùng. Tuy nhiên, việc sàng lọc loại mất đoạn này trong chẩn đoán thông thường vẫn là vấn đề gây tranh cãi giữa các chuyên gia. Phương thức cơ bản của xét nghiệm là dựa trên phản ứng PCR đa mồi (Multiplex – PCR), thích hợp để chẩn đoán chính xác việc xóa đoạn AZF hoàn toàn và nó chỉ cần một sự khác biệt nhỏ trong quần thể có nền nhiễm sắc thể Y cụ thể. Tuy nhiên, theo dữ liệu mới về mối tương quan giữa kiểu hình và kiểu gen, việc phân tích mở rộng cho mất đoạn AZFa và AZFb được khuyến nghị thực hiện thường xuyên. Các phương pháp và bộ kit mới với nhều số lượng marker hơn sẽ không cải thiện độ nhạy của xét nghiệm, thậm chí có thể làm phức tạp việc giải thích kết quả và không nên sử dụng, đồng thời hàng năm nên tham gia các chương trình kiểm soát chất lượng bên ngoài. Kinh nghiệm 12 năm với chương trình EMQN / EAA đã cho thấy tỷ lệ lỗi chẩn đoán (kiểu gen) giảm mạnh và cải thiện đồng thời về thực hành báo cáo.
GIỚI THIỆU
Sau hội chứng Klinefelter, hội chứng vi mất đoạn NST Y là nguyên nhân di truyền thường gặp thứ hai gây vô sinh nam. Trong thập kỷ qua, nhiều nhà điều tra đã mô tả sự xuất hiện của hội chứng vi mất đoạn NST Y ở bệnh nhân vô sinh trên toàn thế giới và xét nghiệm sinh học phân tử mất đoạn đã trở thành một xét nghiệm quan trọng trong chẩn đoán vô sinh nam.
Vi mất đoạn xảy ra ở khoảng 1/4000 nam giới trong dân số nói chung nhưng tần số này cao hơn hẳn ở những người đàn ông vô sinh. Nam giới mắc hội chứng Azoospermic có tỷ lệ vi mất đoạn cao hơn nam giới mắc hội chứng oligozoospermic và do đó tần số xóa đoạn được tìm thấy trong các phòng thí nghiệm khác nhau có thể thay đổi từ 2 đến 10% (hoặc thậm chí cao hơn, Hình 1). Thông thường, các phòng thí nghiệm thông thường nhận được sự giới thiệu từ các tổ chức bên ngoài, mà không có sự lựa chọn bệnh nhân, thì có tỷ lệ mắc thấp hơn nhiều, <2%.
Dữ liệu được công bố và trải nghiệm chương trình kiểm soát chất lượng cho thấy các phương pháp chẩn đoán có thể khá khác nhau và có thể xảy ra sự chẩn đoán không chính xác, cho thấy sự cần thiết của cả tiêu chuẩn hóa và kiểm soát chất lượng. Do đó, EAA và EMQN đã cùng hỗ trợ xuất bản “Hướng dẫn trong phòng thí nghiệm chẩn đoán vi mất đoạn nhiễm sắc thể Y và bắt đầu đưa ra đánh giá chất lượng bên ngoài (EQA)”.
Trong 9 năm qua, các dữ liệu liên quan đến mất đoạn gen cụ thể, mất đoạn/lặp đoạn một phần AZFc và mối tương quan kiểu gen kiểu hình đã được tích lũy. Tất cả những vấn đề này cùng với bản cập nhật về kiểm soát chất lượng EAA / EMQN AZF hoạt động của chương trình đã được tóm tắt trong nghiên cứu này.
CẤU TRÚC CỦA VÙNG ĐẶC BIỆT TRÊN NHIỄM SẮC THỂ Y (MSY)
Bản đồ và trình tự vật lý hoàn chỉnh của MSY đã có sẵn từ năm 2003 (Skaletsky et al., 2003). Thông tin này có được bằng cách giải trình tự và sắp xếp 220 bản sao BAC chứa các phần của MSY từ một người đàn ông. Việc sử dụng chỉ một cá nhân là cần thiết bởi vì, do sự hiện diện của các chuỗi lặp đi lặp lại với sự khác biệt nhỏ chỉ đặc trưng cho các bản sao riêng lẻ của từng chuỗi (biến thể họ chuỗi, SFV), biến thể allelic hoặc tính đa hình sẽ làm giảm sự chính xác của trình tự sắp xếp SFV cần thiết để phân bổ các bản sao BAC. Ba loại trình tự đã được tìm thấy trên MSY: trình tự X-transposed (99% sự đồng nhất với nhiễm sắc thể X), trình tự X thoái hóa (là tàn dư của các nhiễm sắc thể cổ đại từ đó các nhiễm sắc thể X và Y hiện đại phát triển) và trình tự khuếch đại (Ampliconic). Trình tự khuếch đại được đặc trưng bởi các cặp trình tự hiển thị nhận dạng gần như hoàn chỉnh (> 99,9%),bao gồm các vùng lớn. Theo kiến thức hiện tại, MSY chứa 156 đơn vị phiên mã bao gồm 78 gen mã hóa 27 protein. Các Ampliconic bao gồm 60 gen mã hóa và 74 trình tự phiên mã không mã hóa chủ yếu được nhóm lại và được biểu hiện chủ yếu hoặc chỉ trong tinh hoàn. Trình tự ampliconic tái tổ hợp thông qua trao đổi gen, nghĩa là sự chuyển đoạn không tương hỗ xảy ra giữa các trình tự giống nhau trong một nhiễm sắc thể, một quá trình xác định >99,9% nhận dạng giữa các trình tự lặp lại theo cặp theo hướng ngược trong trình tự palindromes (giống nhau khi đọc từ 5 ‘đến 3’ trên một chuỗi và 5 ‘đến 3’ trên chuỗi khác, chuỗi bổ sung)
Bên cạnh việc duy trì thông tin di truyền gen, trình tự đặc biệt này cung cấp cấu trúc cho việc xóa đoạn và sự sắp xếp lại. Người ta cho rằng việc xóa AZF hoàn toàn phát sinh một cách cố định thông qua Tái tổ hợp tương đồng không Allelic (NAHR) diễn ra giữa các trình tự có sự tương đồng cao dẫn đến làm mất vật liệu di truyền giữa chúng. Với cấu trúc của MSY, các cách mất đoạn khác nhau có thể là nguyên nhân của những trường hợp vô sinh nam, dựa trên kiến thức hiện tại sẽ được mô tả ngắn gọn dưới đây.
CƠ CHẾ VÀ CÁC CÁCH MẤT ĐOẠN
Khi mà trình tự của nhiễm sắc thể Y chưa được biết đến hoàn toàn thì ba vùng AZFa, AZFb và AZFc riêng biệt đã được xác định vị trí trên MSY của một số lượng lớn nam giới bị vi mất đoạn nhiễm sắc thể. Sau đó, nhờ đặc tính phân tử của sự mất đoạn, một mô hình mất đoạn mới được đưa ra, trong đó các vùng AZFb và AZFc chồng chéo (Hình 2). Ngoài ra, mất đoạn AZFb và AZFbc đã được cho là kết quả của ít nhất ba loại mất đoạn khác nhau. Mặc dù danh pháp mới phù hợp hơn về mặt sinh học, nhưng từ quan điểm lâm sàng thực tế, có thể áp dụng danh pháp cho các trường hợp xóa hoàn toàn AZFb (P5 / proximal P1) và AZFc (b2 / b4). Mặt khác, sự khác biệt giữa hai phân nhóm AZFbc (P5 / distal P1 và P4 / distal P1) có liên quan đến lâm sàng (xem bên dưới). Chúng tôi cũng cung cấp thông tin về bộ gen của sY-loci được sử dụng cho các phân tích AZF (Phụ lục C), nên được sử dụng để mô tả sự mất đoạn theo danh pháp HGVS như một phần của thông lệ tiêu chuẩn. Mô tả về việc mất đoạn AZFc (b2 / b4) được đưa ra trong ví dụ báo cáo.
Vùng AZFa dài khoảng 1100 kb và chứa các bản gen sao chép đơn USP9Y ( từ DFFRY) và DDX3Y ( từ DBY). Dữ liệu gần đây thu được từ các nhóm nghiên cứu khác nhau đã xác định nguồn gốc của việc mất đoạn AZFa hoàn toàn trong tái tổ hợp hợp tương đồng giữa các vùng có trình tự giống hệt nhau trong các chuỗi retrovirus theo cùng định hướng HERVyq1 và HERVyq2. Trong các retrovirus này, sự tái tổ hợp có thể xảy ở một trong hai vùng trình tự giống hệt nhau (ID1 và ID2), tạo ra hai kiểu mất đoạn chính có sự khác nhau rất nhỏ tại các điểm dừng chính xác của nó. Trong mọi trường hợp,việc mất hoàn toàn vùng AZFa sẽ loại bỏ khoảng 792 kb bao gồm cả gen USP9Y và DDX3Y, hai gen duy nhất trong vùng AZFa.
Loại và cơ chế mất đoạn của vùng AZFb và AZFc đã được làm rõ bởi Kuroda-Kawaguchi et al. Cả hai khu vực này cùng bao gồm khoảng 24 gen, hầu hết trong số đó có mặt trong nhiều bản sao với tổng số 46 bản sao.Việc mất hoàn toàn AZFb sẽ loại bỏ 6,2 Mb (bao gồm 32 bản sao gen và các đơn vị phiên mã) và kết quả từ sự tái hợp tương đồng giữa các palindromes P5 / proximal P1
Vùng AZFc bao gồm 12 gen và đơn vị phiên mã,mỗi đơn vị có mặt trong một số lượng bản sao khác nhau, tạo ra tổng cộng 32 bản sao. Việc mất đoạn hoàn toàn của AZFc, kiểu thường gặp nhất ở những người đàn ông bị mất đoạn nhiễm sắc thể Y, loại bỏ 3,5 Mb, bắt nguồn từ sự tái tổ hợp tương đồng giữa các bộ khuếch đại b2 và b4 trong palindromes P3 và P1, loại bỏ 21 bản sao các gen. Việc mất cả AZFb và AZFc cùng xảy ra bởi hai cơ chế chính liên quan đến tái tổ hợp tương đồng giữa P5 / vùng ngoại biên P1 (loại bỏ 7,7 Mb và 42 bản sao) hoặc giữa P4 / vùng ngoại biên P1 (loại bỏ 7,0 Mb, 38 bản sao)
Do đó, theo kiến thức hiện tại, các vi mất đoạn dưới đây của nhiễm sắc thể Y sẽ liên quan đến các trường hợp lâm sàng tìm thấy ở những người đàn ông mắc bệnh Oligozoospermia (tinh trùng ít) hoặc azoospermia (tinh dịch không có tinh trùng) nặng (Hình 2):
- AZFa
- AZFb (P5 / proximal P1),
- AZFbc (P5 / P1 xa hoặc P4 / P1 xa),
- AZFc (b2 / b4).
Kiểu mất đoạn thường xuyên nhất là xóa vùng AZFc (~ 80%), sau đó là AZFa (0,5 – 4%), AZFb (1 – 5%) và xóa AZFbc (1 – 3%). Việc mất đoạn được phát hiện là AZFabc rất có thể liên quan đến bộ nhiễm sắc thể bất thường như NST 46, XX nam hoặc iso (Y).
MẤT ĐOẠN gr/gr
Vùng AZFc đặc biệt nhạy cảm với NAHR (Tái tổ hợp tương đồng không alle) có thể gây ra sự hình thành mất đoạn và lặp đoạn dẫn đến thay đổi số lượng gen. Mặc dù mới chỉ có một vài kiểu mất đoạn AZFc được mô tả, nhưng một trong số đó đã là vấn đề lâm sàng rất quan trọng. Mất đoạn ‘gr / gr này được đặt tên theo các đầu dò huỳnh quang (’ màu xanh lá cây và ‘màu đỏ) được mô tả trong lần sử dụng đầu tiên.
Mặc dù nó loại bỏ một nửa số lượng gen AZFc (gen có biểu hiện chuyên biệt hoặc chiếm ưu thế trong tế bào mầm), nhưng ý nghĩa lâm sàng của nó vẫn còn là vấn đề gây tranh cãi, bởi vì người mang có thể biểu hiện các kiểu hình tinh trùng biến đổi cao từ azoo đến normozoospermia. Rõ ràng ảnh hưởng của việc mất đoạn phần lớn phụ thuộc vào nguồn gốc dân tộc và địa lý của dân số nghiên cứu. Trên thực tế, tần số xuất hiện và kiểu hình có thể khác nhau giữa các nhóm dân tộc khác nhau, trên cơ sở nền tảng nhiễm sắc thể Y; ví dụ, trong các nhóm haplog Y cụ thể, chẳng hạn như D2b, Q3 và Q1, phổ biến ở Nhật Bản và một số khu vực của Trung Quốc, việc mất đoạn tồn tại và dường như không có tác động tiêu cực đến quá trình sinh tinh trùng. Tranh cãi cũng liên quan đến xu hướng lựa chọn nghiên cứu (thiếu sự lựa chọn dân tộc kết hợp địa lý của các trường hợp và lựa chọn không phù hợp các nam giới vô sinh) và các vấn đề phương pháp luận (thiếu xác nhận mất gen). Nhiều nỗ lực đã được thực hiện để làm rõ cơ sở phân tử cho sự xuất hiện kiểu hình biến đổi cao của loại mất đoạn này. Trước đây người ta đã mô tả rằng việc mất DAZ1/DAZ2 và CDY1 là phổ biến (hoặc đặc trưng) ở những người bị suy giảm sản xuất tinh trùng đồng thời cũng đưa ra giả thuyết rằng rằng việc phục hồi lượng gen AZFc bình thường trong trường hợp mất đoạn gr/gr và lặp đoạn b2/b4 có thể giải thích sự giảm ảnh hưởng đến số lượng tinh trùng. Về vấn đề này, một nghiên cứu đa trung tâm đã được diễn ra, dựa trên các phương pháp tổng hợp (liều lượng gen, định nghĩa mất đoạn gen DAZ và CDY1, định nghĩa Y hgr) đã được thực hiện trên người da trắng. Mặc dù đã mô tả chi tiết các kiểu mất đoạn nhỏ gr/gr dựa trên loại bản sao gen bị thiếu và phát hiện sự sắp xếp lại chuỗi thứ cấp (mất đoạn cùng với lặp đoạn b2 / b4) cùng với định nghĩa của các nhóm haplogroup,nhưng vẫn không thể xác định một mẫu cụ thể sẽ liên quan đến biểu hiện ‘trung tính’ hoặc ‘gây bệnh’. Ngược lại, các nghiên cứu liên quan đến người châu Á dường như ủng hộ giả thuyết về sự biểu hiện kiểu hình phụ thuộc kiểu mất đoạn và về tầm quan trọng của bản chất NST Y mà việc mất đoạn có thể xuất hiện. Ngoài việc nghiên cứu các trường hợp cơ bản và có kiểm soát nhằm xác định liệu việc mất đoạn gr/gr có gây nguy cơ rối loạn sinh tinh hay không, phân tích các bệnh nhân liên tiếp thông qua việc nghiên cứu cắt ngang cho thấy việc xóa gr/gr có ảnh hưởng ngay cả trong phạm vi số lượng tinh trùng bình thường. Thực tế, người ta đã quan sát thấy rằng những người mang có Normozoospermic (tinh dịch đồ bình thường) có số lượng tinh trùng thấp hơn đáng kể so với những người đàn ông có NST Y nguyên vẹn. Ngoài ra, báo cáo cũng chỉ rằng, trong dân số Trung Quốc, tần số mất đoạn giảm mạnh trong các nhóm nhỏ với nồng độ tinh trùng > 50 x 10^6 / mL.
Việc sàng lọc mất đoạn gr/gr dựa trên phương pháp PCR plus/minus sử dụng hai markers (sY1291 và sY1191) và chẩn đoán dựa trên việc marker Y1291 không lên và xuất hiện marker sY1191. Điều đáng chú ý là tỷ lệ mất đoạn này sai số 5% đã được phát hiện trong nghiên cứu đa trung tâm,từ đó nhấn mạnh tầm quan trọng của việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng PCR, các bước của chu trình phản ứng PCR và cuối cùng là phân tích số lượng gen. Định nghĩa của haplogroup xuất hiện ở bệnh nhân châu Á để loại trừ hình thành mất đoạn không có khả năng làm ảnh hưởng đến sự sinh tinh trùng (xem ở trên).
Ý NGHĨA LÂM SÀNG
Như đã nêu ở trên, sự không đồng nhất của các quần thể nghiên cứu trong tài liệu làm phân tích tổng hợp giảm độ đáng tin cậy. Tuy nhiên, bốn phân tích tổng hợp đã được thử về chủ đề này tất cả đều đạt được tỷ lệ đáng kể trong các báo cáo, trung bình tăng gấp từ 2 đến 2,5 lần nguy cơ giảm sản lượng/vô sinh của tinh trùng. Do đó, việc mất đoạn gr/gr đại diện cho một ví dụ duy nhất về nguyên nhân và yếu tố di truyền nguy cơ quan trọng đã được xác nhận đối với sự suy yếu sản xuất tinh trùng. Ví dụ, trong dân số Ý, mất đoạn gr/gr có nguy cơ suy giảm khả năng sinh tinh cao gấp 7,9 lần (OR = 7,9, 95% CI 1.8 – 33.8).
Việc mất đoạn gr/gr (yếu tố di truyền nguy cơ cao đối với việc suy yếu sản xuất tinh trùng) sẽ di truyền hoàn toàn cho con cái. Việc mất đoạn một phần có thể mở rộng thành mất đoạn hoàn toàn AZFc (là yếu tố nguyên nhân đặc trưng gây suy giảm tinh trùng) ở các thế hệ tiếp theo, nhưng dữ liệu hiện tại vẫn chưa đủ để đưa ra kết luận cuối cùng về nguy cơ cụ thể này. Việc mất đoạn gr/gr cũng đã được đề xuất là yếu tố di truyền nguy cơ đối với bệnh ung thư tinh hoàn nhưng kết luận này vẫn đang chờ xác nhận thêm bởi các quần thể nghiên cứu độc lập lớn.
Chi phí thấp của thử nghiệm có thể là nguyên nhân khiến cho thử nghiệm thông thường có tỉ lệ rủi ro cao (tại Ý, Tây Ban Nha, Hà Lan và Trung Quốc). Tuy nhiên, hiện tại chưa có quy trình tư vấn chung nào được đề ra để kiểm tra vấn đề này.
PHÂN LẬP MẤT ĐOẠN GEN AZF
Mặc dù một số tác giả tìm thấy tần số cao bất thường trong số các lần mất đoạn gen AZF, nhưng những dữ liệu này hoàn toàn trái ngược với kinh nghiệm chung được tích lũy ở >2000 bệnh nhân được thử nghiệm ở nơi khác. Việc mất đoạn gen cụ thể là cực kỳ hiếm và tất cả năm loại mất đoạn đã được xác nhận (với định nghĩa về các điểm dừng) đã loại bỏ hoàn toàn hoặc một phần gen USP9Y thuộc vùng AZFa. Không có sự mất đoạn nào là do NAHR và điều đó có khả năng là thứ duy nhất làm cho trường hợp này hiếm khi xảy ra. Sự liên kết kiểu hình giữa tinh dịch/tinh hoàn có liên quan phần lớn giữa những người mang USP9Y (từ azoospermia (tinh dịch khôn có tinh trùng) gây ra bởi hyposepermatogenesis (giảm sinh tinh) đến Normozoospermia (tinh dịch đồ bình thường)) chỉ ra rằng gen này hoạt động như một yếu tố điều chỉnh hơn là một yếu tố thiết yếu cho sự sinh tinh trùng. Dựa trên sự vắng mặt của các mất đoạn gen USP9Y khác trong tài liệu, việc xét nghiệm sàng lọc phân lập mất đoạn gen không được khuyến cáo trong các chẩn đoán thông thường. Cho rằng các bộ kits thương mại có chứa các markers đặc trưng cho gen, cần phải thận trọng cả về việc xác nhận mất đoạn gen đơn nghi ngờ cũng như việc giải thích kết quả.
TƯƠNG QUAN KIỂU GEN KIỂU HÌNH TRONG MẤT ĐOẠN HOÀN TOÀN AZF
Việc mất đoạn AZF là đặc hiệu cho sự bất hoạt của tinh trùng vì không có mất đoạn nào được báo cáo ở một số lượng lớn người đàn ông Normozoospermic (tinh dịch đồ bình thường). Mặc dù khả năng sinh sản có thể tương thích với những mất đoạn này, nhưng thực tế thụ tinh tự nhiên vẫn có thể xảy ra ngay cả với số lượng tinh trùng thấp tùy thuộc vào tình trạng sinh sản của người đàn ông. Vì lý do này, sẽ thích hợp hơn khi xem xét việc mất đoạn Y là nguyên nhân gây ra bệnh oligo/azoospermia (tinh trùng ít/tinh dịch không có tinh trùng) hơn là nguyên nhân gây ra tình trạng vô sinh.
Việc xóa toàn bộ vùng AZFa luôn dẫn đến hội chứng chỉ có tế bào sertoli (SCOS) và azoospermia (tinh dịch không có tinh trùng). Chẩn đoán mất đoạn hoàn toàn vùng AZFa có nghĩa là không thể lấy được tinh trùng từ tinh hoàn để tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI).Việc mất đoạn hoàn toàn AZFb và AZFbc (P5/proximal P1, P5/distal P1, P4/distal P1) được đặc trưng bởi hình ảnh mô học của SCOS hoặc ngừng sinh tinh trùng dẫn đến azoospermia (tinh dịch không có tinh trùng). Một số báo cáo đã chỉ ra rằng tương tự như việc mất đoạn hoàn toàn vùng AZFa, không tìm thấy tinh trùng trong kỹ thuật vi phẫu trích tinh trùng từ tinh hoàn (TESE) ở những bệnh nhân này.
Tuy nhiên, trong cả ba trường hợp, sự giảm hoạt động tinh trùng và crypto/oligozoospermia đã được báo cáo liên quan đến việc mất đoạn hoàn toàn AZFb hoặc AZbc. Giải thích sinh học của các kiểu hình bất thường vẫn chưa rõ ràng, bản chất của NST Y và sự khác biệt trong phạm vi chính xác của việc mất đoạn có thể giải thích cho hiện tượng này. Trên thực tế, những mất đoạn nhỏ, với điểm dừng gần nhất tại P4 có thể liên quan đến việc giữ lại các bản sao gen AZFb như XKRY, CDY2 và HSFY. Do đó, người ta cho rằng kiểu hình sẽ nghiêm trọng hơn trong trường hợp loại bỏ hoàn toàn vùng AZFb. Với rất ít trường hợp ngoại lệ được báo cáo trong tài liệu, chẩn đoán mất đoạn hoàn toàn AZFb hoặc AZFbc (P5/proximal P1, P5/distal P1, P4/distal P1) thì cơ hội lấy tinh trùng từ tinh hoàn gần như bằng 0.
Việc mất đoạn AZFc (b2/b4) liên kết với sự thay đổi kiểu hình lâm sàng và mô học. Nhìn chung, việc mất đoạn AZFc tương thích với sự sinh tinh trùng còn sót lại và do đó cũng có thể được tìm thấy ở những người đàn ông mắc bệnh oligozoospermia nghiêm trọng và, trong những trường hợp hiếm hoi, thậm chí có thể sẽ truyền sang thế hệ con cái. Ở những người đàn ông bị azoospermia và mất đoạn AZFc, có khoảng 50% cơ hội lấy tinh trùng từ TESE và em bé có thể được thụ thai bằng ICSI. Tỷ lệ thành công của TESE chủ yếu phụ thuộc vào kỹ thuật được sử dụng, thấp nhất là 9% và cao nhất có thể tới 70 – 80% sau micro-TESE. Theo một báo cáo, sự hiện diện của 45, dòng tế bào X trong máu có thể là yếu tố dự đoán xấu cho sự sinh tinh trùng.
CHỈ ĐỊNH XÉT NGHIỆM PHÂN TỬ NST Y
Chẩn đoán vi mất đoạn của nhiễm sắc thể Y cho phép xác định nguyên nhân của bệnh nhân azoospermia / oligozoospermia từ đó hình thành một tiên lượng.Khi nào thì các bệnh nhân nên thực hiện xét nghiệm sàng lọc phân tử nhiễm sắc thể Y? Từ các tài liệu thế giới, dựa trên hàng ngàn bệnh nhân được sàng lọc, chỉ ra rằng, theo quy luật, việc mất đoạn có liên quan đến lâm sàng được tìm thấy ở những bệnh nhân mắc bệnh azoospermia hoặc oli-gozoospermia nặng với nồng độ tinh trùng <2×10^6 / mL. Rất hiếm khi, mất đoạn có thể được tìm thấy ở những bệnh nhân vô sinh với nồng độ tinh trùng trong khoảng từ 2- 5×10^6 / mL. Chúng tôi cung cấp một biểu đồ dòng chảy với các chỉ định và bao gồm các bước phân tích được đề xuất trong Hình 3. Các thông số lâm sàng thông thường như nồng độ hormone, thể tích tinh hoàn, varicocoele (giãn tĩnh mạch thừng tinh), tinh hoàn maldescended, nhiễm trùng, vv không có bất kỳ giá trị tiên đoán nào. Nói chung, xét nghiệm phân tử nhiễm sắc thể Y không được chỉ định với các bệnh nhân có bất thường nhiễm sắc thể (ngoại trừ karyotype 46, XY / 45, X), azoospermia tắc nghẽn (trừ khi FSH vượt quá giới hạn bình thường) hoặc suy sinh dục hypogonadotropic. Tuy nhiên, trong tài liệu có một số ví dụ về những người mang mầm bệnh trong số những người đàn ông vô sinh không vô căn, ví dụ, với một khối u tinh hoàn hoặc sau khi hóa trị liệu, sẽ được xem xét để giải thích cho sự bất hoạt của tinh trùng. Do đó, bất kỳ chẩn đoán nào kèm theo azoo- hoặc oligozoospermia nặng sẽ là một chỉ định cho xét nghiệm AZF. Ví dụ, ở những người đàn ông thuộc các loại tinh dịch nói trên, sàng lọc AZF rất quan trọng trước khi phẫu thuật giãn tĩnh mạch vì người mang mầm bệnh rất có thể sẽ không có lợi từ quá trình phẫu thuật.
Mất đoạn AZF ở các bệnh nhân Klinefelter đã được báo cáo trong hai nghiên cứu với tỷ lệ khá cao,từ đó đặt ra câu hỏi là liệu có nên thực hiện sàng lọc mất đoạn thường xuyên ở những người đàn ông này hay không. Tuy nhiên, việc mất đoạn được mô tả và chẩn đoán chủ yếu chỉ bằng các dấu hiệu phân lập của AZFa hoặc vùng AZFb, không được xác nhận lại bằng các phân tích bổ sung khác. Ngược lại, ba nghiên cứu lớn khác không tìm thấy bất kỳ mất đoạn AZF nào ở bệnh nhân Klinefelter. Bệnh nhân mắc chứng azoospermia có thể thực hiện kỹ thuật TESE / ICSI nên được đề nghị sàng lọc mất đoạn vì TESE không nên được thực hiện trong trường hợp bệnh nhân mất đoạn hoàn toàn vùng AZFa. Những người mắc azoospermic mất đoạn vùng AZFb hoặc AZFbc với điểm dừng gần nhất trong palindrom P4 cuối cùng có thể thử kỹ thuật micro-TESE. Tuy nhiên, bệnh nhân nên được thông báo đầy đủ về việc cơ hội rất thấp hoặc hầu như không thể lấy tinh trùng. Sinh thiết thông thường (không có thiết bị vi phẫu) không bao giờ nên được thực hiện trong những trường hợp này. Do đó, chẩn đoán mất đoạn có giá trị tiên lượng và có thể ảnh hưởng đến việc lựa chọn điều trị.
TƯ VẤN DI TRUYỀN
Tư vấn di truyền là trình tự bắt buộc để cung cấp thông tin cho bệnh nhân về nguy cơ thụ thai con trai bị suy giảm khả năng sinh tinh. Trong trường hợp mất đoạn một phần AZFa hoặc AZFb và AZFc, việc tư vấn (với xét nghiệm AZF) cũng phù hợp với các thành viên nam khác trong gia đình vì việc truyền các loại mất đoạn này đã được báo cáo trong tài liệu. Mất đoạn hoàn toàn AZFa, AZFb, AZFbc hoặc AZFabc thường không tương thích với sản xuất tinh trùng do đó không cần chỉ định sàng lọc trong gia đình. Một số nghiên cứu đã được công bố về ICSI được thực hiện ở các cặp vợ chồng có người đàn ông mang AZFc mất đoạn. Mặc dù tỷ lệ thụ tinh và chất lượng phôi thấp hơn, tỷ lệ phôi nang bị suy giảm đáng kể và tỷ lệ thành công của ICSI thấp hơn so với báo cáo, phần lớn các nghiên cứu báo cáo không có sự khác biệt đáng kể về thụ tinh và tỷ lệ mang thai giữa những người đàn ông có hoặc không có mất đoạn NST Y. Trong khi việc mất đoạn ở người cha chắc chắn sẽ truyền sang con trai, người con sẽ bị suy giảm khả năng sản xuất tinh trùng, kiểu hình tinh hoàn chính xác không thể dự đoán được do nền tảng di truyền khác nhau và tác động của các yếu tố môi trường đến khả năng sinh sản của cha và con trai.
Những lo ngại đã được đặt ra về nguy cơ tiềm ẩn của hội chứng Turner (45, X) ở con cái và các dị thường kiểu hình khác liên quan đến bệnh khảm nhiễm sắc thể giới tính, không rõ ràng cơ quan sinh dục. Dữ liệu về những người đàn ông có vi mất đoạn NST Y và những bệnh nhân mang thể khảm 46,XY/45,X với giới tính không rõ ràng hoặc dấu hiệu bệnh Turner cho thấy rằng một số vi mất đoạn Yq có liên quan đến sự mất ổn định tổng thể nhiễm sắc thể Y từ đó có thể dẫn đến sự hình thành dòng tế bào 45,X. Trong các báo cáo, số trẻ em từ ICSI được sinh ra từ những người cha bị ảnh hưởng bởi vi mất đoạn vẫn còn tương đối thấp, gần 50. Hầu hết các em bé có kiểu hình bình thường, ngoại trừ một bé trai sinh ra bị bệnh phổi, có tâm thất phải bất thường và không có cơ quan sinh dục rõ ràng hoặc mắc hội chứng Turner. Ta thấy rằng các phôi mang karyotype 45,X có nguy cơ sảy thai tự nhiên rất cao, nhưng điều quan trọng là phải biết liệu tỷ lệ sảy thai tự nhiên có cao hơn trong số các trường hợp người nam bị mất đoạn Y hay không. Hai nghiên cứu cung cấp dữ liệu về tỷ lệ đột biến lệch bội trong phôi bằng cách thực hiện chẩn đoán di truyền tiền ghép ở phôi có nguồn gốc từ những người mang đột biến mất đoạn nhiễm sắc thể Y. Trong nghiên cứu đầu tiên, không có bất thường nhiễm sắc thể giới tính nào được tìm thấy, trong khi đó, tỷ lệ phôi bất thường cao, với sự gia tăng đáng kể tỷ lệ phôi với X đơn sắc đối với bệnh nhân mắc oligozoospermic mà không có mất đoạn NST Y. Từ đó thấy rằng phải thận trọng thảo luận về rủi ro này với bệnh nhân trước khi chẩn đoán trước sinh.
Gần đây, Jorgez và cộng sự. (2011) đã báo cáo việc phát hiện sự đơn bội của SHOX (Short-stature HOmeoboX-containing) nằm ở vùng pseudoautosomal 1 (PAR1) trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể Y ở 5,4% nam giới bị mất đoạn AZF và karyotype bình thường. Họ đặt ra câu hỏi về tầm quan trọng của việc sàng lọc các biến thể số lượng bản sao được liên kết với SHOX ở những người đàn ông mang vi mất đoạn. Tuy nhiên, một nghiên cứu đa trung tâm lớn hơn nhiều sau đó đã không tìm thấy mối liên quan giữa các nhiễm sắc thể nhiễm sắc thể Y và đơn bội SHOX, cho rằng những người mang mất đoạn không có nguy cơ gia tăng các bệnh lý liên quan đến SHOX (tầm vóc thấp bé và dị thường xương)
Tóm lại, chỉ định chẩn đoán phân tử vi mất đoạn phải dựa trên nồng độ tinh trùng và nó được khuyến cáo mạnh mẽ ở những bệnh nhân bị ảnh hưởng bởi azoospermia và oligozoospermia nặng (<5×106/mL). Xét nghiệm AZF có giá trị tiên lượng cho việc thu hồi tinh trùng và trong trường hợp tinh trùng có thể được tìm thấy trong xuất tinh hoặc bằng sinh thiết tinh hoàn (micro-TESE thay vì TESE thông thường) việc mất đoạn chắc chắn sẽ truyền sang con cái. Tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ mang thai tương tự nhau ở nam giới không mất đoạn, nhưng chất lượng phôi và tỷ lệ phôi nang thấp hơn cũng đã được mô tả. Chúng tôi vẫn chưa có thông tin kết luận về nguy cơ thực sự của hội chứng Turner, không rõ cơ quan sinh dục hoặc các bất thường nhiễm sắc thể khác vì dữ liệu khan hiếm. Nên phân tích các thành viên nam của gia đình trong trường hợp mất đoạn AZFc hoặc AZFb hoặc AZFa. Hơn nữa, karyotype biểu thị sự xuất hiện của việc mất đoạn thiết bị đầu cuối AZFc hoặc Yq để loại trừ khảm khảm 46, XY/45, X.
HƯỚNG DẪN XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN
Xét nghiệm chẩn đoán mất được thực hiện bằng cách khuếch đại PCR các vùng được chọn của nhiễm sắc thể Y. Các đoạn mồi STS dành riêng cho MSY khuếch đại cả trình tự ẩn danh của nhiễm sắc thể hoặc gen và hiện có thể được nêu ra chính xác. Mặc dù bản đồ của MSY hiện đã được biết, nhưng chúng ta hầu như không biết gì về vai trò của từng gen và đơn vị phiên mã trong quá trình sinh tinh và vai trò nguyên nhân của chúng đối với vô sinh. Điều đó đã được chứng minh rằng việc sử dụng các đoạn mồi STS dành riêng cho các gen rời rạc không làm tăng tỷ lệ phát hiện các vi mất đoạn liên quan đến lâm sàng trong các mẫu DNA từ các ứng cử viên ICSI. Do đó, về cơ bản vẫn không quan trọng cho dù các đoạn mồi STS được sử dụng khuếch đại các vùng ẩn danh hoặc các gen MSY cụ thể. Điều quan trọng trong chẩn đoán là các đoạn mồi STS có nguồn gốc từ các vùng của nhiễm sắc thể Y không đa hình và được biết đến là bị mất đoạn đặc biệt ở những người đàn ông bị ảnh hưởng bởi oligo- / azoospermia có vi mất đoạn liên quan về mặt lâm sàn. Trình tự của MSY và cơ chế nằm dưới các vi mất đoạn đã cho thấy rằng có một vùng AZFd thứ tư giả định được đưa ra bởi Kent-First et al. không tồn tại.
PHƯƠNG THỨC PCR VÀ KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG NỘI CHUẨN
Sự khuếch đại PCR DNA bộ gen để chẩn đoán lâm sàng đòi hỏi tuân thủ nghiêm ngặt với thực hành tốt trong phòng thí nghiệm và các nguyên tắc cơ bản của kiểm soát chất lượng. Cần tuân thủ cẩn thận các hướng dẫn về kiểm soát chất lượng nội bộ khi thực hiện chẩn đoán các vi mất đoạn nhiễm sắc thể Y. Song song với mẫu DNA bệnh nhân, một mẫu nữ phải được xử lý như một biện pháp kiểm soát ô nhiễm DNA trong toàn bộ quy trình. Mỗi bộ phản ứng PCR nên được thực hiện ít nhất là trong phản ứng kép hoặc, hoặc multiplex PCR. Phản ứng đa mồi rất hữu ích để phân biệt kết quả âm tính với lỗi kỹ thuật thông qua việc sử dụng kiểm soát nội chuẩn. Một kiểm soát PCR nội chuẩn thích hợp trong chẩn đoán AZF với gen ZFX/ZFY vì các đoạn mồi khuếch đại một đoạn duy nhất với cả DNA nam và nữ tương ứng. Chứng dương và chứng âm phải được chạy song song với mỗi sản phẩm đa mồi. Chứng dương và chứng âm là một mẫu DNA từ một người đàn ông có khả năng sinh tinh bình thường và từ một người phụ nữ tương ứng. Ngoài ra, một mẫu nước, chứa tất cả các thành phần phản ứng chứa nước thay vì DNA, phải được chạy cùng để kiểm soát sự nhiễm bẩn.
Tóm lại, việc chẩn đoán các vi mất đoạn của nhiễm sắc thể Y phải được thực hiện bằng cách khuếch đại PCR (đa mồi) DNA genomic, sử dụng ZFX / ZFY làm chứng nội chuẩn PCR. Một mẫu DNA từ một người đàn ông khỏe mạnh và từ một phụ nữ và mẫu blank (nước) phải được chạy song song.
BỘ MỒI CƠ BẢN CỦA STS
Về nguyên tắc, việc phân tích chỉ một locus STS không đa hình trong mỗi vùng AZF là đủ để xác định xem có bất kỳ mất đoạn STS nào có trong AZFa, AZFb hoặc AZFc hay không. Tuy nhiên, việc phân tích hai locus STS ở mỗi vùng sẽ củng cố độ chính xác chẩn đoán, vì việc mất đoạn liên quan đến các vùng được xác định rõ bao gồm nhiều locus STS. Do đó, cần ít nhất hai locus STS trong mỗi vùng AZF cần được phân tích. Dựa trên kinh nghiệm của nhiều phòng thí nghiệm, kết quả kiểm soát chất lượng bên ngoài và xem xét định dạng PCR đa mồi, lựa chọn đầu tiên của mồi STS được đề xuất trong các phiên bản trước của hướng dẫn vẫn còn hiệu lực (Hình 3 3). Những mồi đó bao gồm:
- Cho AZFa: sY84, sY86
- Cho AZFb: sY127, sY134
- Cho AZFc: sY254, sY255 (cả trong gene DAZ)
Các mồi STS này đã được chứng minh là mang lại kết quả mạnh mẽ và có thể tái tạo trong các phản ứng PCR đa mồi của một số phòng thí nghiệm và trong các thử nghiệm kiểm soát chất lượng bên ngoài. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng theo trình tự chất lượng cao mới nhất, có một sự không phù hợp ở giữa các trình tự của đoạn mồi sY84-F (không loại trừ hiệu quả của khuếch đại) và do đó trình tự đã được thay đổi trong bảng phù hợp. Liên quan đến sY84-R a SNP (rs72609647) có mặt trong nucleotide thứ 5 của trình tự mồi. Trong trường hợp khuếch đại thất bại, cần kiểm tra STS thay thế gần đó sY84; đối với các điểm đánh dấu lân cận, xem ‘MSY mappoint mapper. Nên đưa gen SRY vào phân tích để kiểm soát yếu tố xác định tinh hoàn trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể Y và cho sự xuất hiện của các chuỗi đặc hiệu Y khi không có gen ZFY. Việc kiểm tra ZFX không chỉ phù hợp với DNA đối chứng nữ mà còn ở nam giới SRY âm tính 46, XX vì đây sẽ là marker dương duy nhất.
Tóm lại, tập hợp các đoạn mồi PCR nên được sử dụng trong các phản ứng PCR đa mồi là lựa chọn tốt nhất để chẩn đoán vi mất đoạn của vùng AZFa, AZFb và AZFc bao gồm: sY14 (SRY), ZFX / ZFY, sY84, sY86, sY86, sY86 , sY254, sY255. Vị trí của các đoạn mồi trên nhiễm sắc thể Y được chỉ ra trong hình 2. Trình tự các đoạn mồi và ví dụ về phương thức PCR được báo cáo trong Phụ lục. Việc sử dụng bộ mồi này sẽ cho phép phát hiện gần như tất cả các mất đoạn có liên quan đến lâm sàng và hơn 95% các trường hợp mất đoạn được báo cáo trong tài liệu ở ba vùng AZF và đủ để chẩn đoán định kỳ. Việc áp dụng bộ mồi này ở tất cả các phòng thí nghiệm được khuyến khích mạnh mẽ vì nó cho phép tiêu chuẩn hóa tối thiểu và so sánh tốt về hiệu suất của phòng thí nghiệm và tính biến thiên liên phòng.
Ý NGHĨA CỦA BỘ MỒI CƠ BẢN VÀ PHÂN TÍCH MỞ RỘNG
AZFa
Phân tích phân tử của vùng AZFa liên quan đến việc sử dụng hai marker STS sY84 và sY86. Cả hai điểm đánh dấu đều nằm ở đầu của gen USPY9 và DDX3Y và là ẩn danh. Theo cơ chế gây bệnh của việc mất đoạn và trải nghiệm hiện tại, một khi mất đoạn cả sY84 và sY86, khả năng xử lý mất đoạn hoàn toàn là rất cao. Tuy nhiên, vì việc mất đoạn một phần AZFa đã được mô tả trong tài liệu và biểu hiện kiểu hình của chúng nhẹ hơn so với mất đoạn hoàn toàn, định nghĩa về việc mở rộng mất đoạn hiện nay là bắt buộc (trái ngược với hướng dẫn trước đây).
Việc xác định mở rộng mất đoạn (hoàn toàn/không hoàn toàn) nên được thực hiện bằng cách sử dụng các đoạn mồi STS sY82 (xuất hiện), sY83 (không xuất hiện hoặc xuất hiện tùy thuộc vào loại điểm dừng) hoặc sY1064 (không xuất hiện) cho đầu gần tiếp giáp và sY1065 hoặc sY1182 (không xuất hiện), sY88 (xuất hiện) cho vùng ngoại biên tiếp giáp (Hình 3B). Dấu sY87 không được khuyến nghị sử dụng nó nằm giữa hai gen AZFa. Một cách xác định cụ thể hơn về các điểm dừng có thể thu được bằng phương thức được đề xuất bởi Kamp et al. (2001). Nếu chỉ một trong hai locus AZFa STS (chỉ sY84 hoặc chỉ sY86) bị mất và có thể loại trừ các lỗi khuếch đại, vùng AZFa cần được nghiên cứu để kiểm tra chi tiết hơn về sự xuất hiện/không xuất hiện của hai gen AZFa (DDX3Y và USP9Y) và các vùng tiếp giáp theo bản đồ được cung cấp bởi Kamp et al. (2001) hoặc định nghĩa về các điểm dừng có thể được thực hiện bằng cách tham khảo cơ sở dữ liệu có sẵn công khai được đề cập trước đó ‘MSY breakpoint mapper. Sự kiện này, tuy nhiên, hiện được coi là cực kỳ hiếm.
Hai điểm marker sY127 và sY134 được đặt tại phần trung tâm và ngoại biên của vùng AZFb. Theo kiến thức hiện tại, trong phần lớn các trường hợp, việc mất đoạn cả hai marker cho thấy việc mất đoạn hoàn toàn vùng AZFb. Tuy nhiên, như đã đề cập trước đây, cho các mục đích dự đoán trước TESE, hiện tại – và ngược lại với các hướng dẫn trước đây – bắt buộc phải thực hiện các phân tích bổ sung với các marker sau: sY105 (xuất hiện) và sY121 hoặc sY1224 (không xuất hiện) cho proximal viền và sY143 hoặc sY1192 (không xuất hiện) và sY153 (xuất hiện) cho vùng ngoại biên tiếp giáp (Hình 3B). Các marker sY114 và sY52 không được khuyến khích sử dụng nữa vì đây là ánh xạ tới nhiều vùng gen. Một định nghĩa chính xác hơn về các điểm dừng có thể được xác định bằng cách tham khảo ‘MSY breakpoint mapper’
AZFc (b2 / b4)
Hai dấu hiệu sY254 và sY255 là đặc trưng cho gen DAZ, xuất hiện trong trình tự nhiễm sắc thể Y tham chiếu trong bốn bản sao được sắp xếp thành hai phức hợp của hai gen, mỗi gen theo hướng từ đầu đến đầu nằm ở palindromes P2 và P1, tương ứng, trong chuỗi MSY liên quan. Sự vắng mặt của cả hai marker cho thấy việc mất đoạn toàn bộ khu vực AZFc sẽ loại bỏ tất cả các bản sao của DAZ. Theo kiến thức hiện tại, việc mất đoạn chỉ một trong hai điểm này là không thể và nên luôn luôn được coi là một lỗi kỹ thuật. Kinh nghiệm được tích lũy cho đến bây giờ đã chỉ ra rằng khi cả hai marker sY254 và sY255 bị mất đoạn, chẩn đoán mất đoạn hoàn toàn vùng AZFc có thể xảy ra. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng mô hình mất đoạn AZFc không đổi, mặc dù không phải lúc nào cũng giống hệt nhau. Các mồi được chỉ định bởi Kuroda-Kawagu-chi et al. (2001) và phân tích sY160 (dấu heterochromatin) cho phép phòng thí nghiệm xác định xem việc mất đoạn tương ứng với mẫu b2 / b4 (Hình 3B). Việc mất đoạn thiết bị đầu cuối (không có sY160) thường được liên kết với kiểu nhân khảm (46, XY/45, X) và do đó yêu cầu phân tích karyotype. Sự hiện diện của dòng tế bào 45,X đã được coi là một yếu tố tiên lượng tiêu cực cho sự xuất hiện của tinh trùng trong tinh hoàn.
AZFbc (P5/distal P1 hoặc P4/distal P)
Việc mất đoạn hoàn toàn cả hai vùng AZFb và AZFc được biểu thị bằng việc thiếu khuếch đại của cả bốn điểm đánh dấu sY127, sY134, sY254 và sY255. Việc sử dụng các marker cụ thể hơn theo chỉ định của Repping et al. (2002) xác định xem việc mất đoạn tương ứng với mẫu P5/distal P1 hay P4/distal P1 (sY116 là xuất hiện trong trường hợp P4/distal P1 và không xuất hiện trong trường hợp P5/distal P1). Định nghĩa này có giá trị tiên lượng lâm sàng như đã nêu ở trên. Ngoài ra, ở những bệnh nhân này, có thể kiểm tra sY160 (dấu hiệu heterochromatine) để xác định xem đó có phải là mất đoạn cuối hay không.
GIẢI THÍCH KẾT QUẢ, KIỂM SOÁT VÀ LẶP LẠI XÉT NGHIỆM
Phương thức được đề xuất bởi các hướng dẫn này (xem phụ lục) được hình thành và tối ưu hóa sao cho mỗi trong hai bộ đa mồi phản ứng chứa một điểm đánh dấu cho từng vùng AZF. Do đó, khi mất đoạn hoàn toàn xảy ra trong một mẫu, cả hai phản ứng PCR sẽ cho thấy sự thiếu khuếch đại cho điểm đánh dấu cụ thể cho khu vực đó. Mặc dù việc mất đoạn một phần vùng AZFa và AZFb, được biểu thị bằng việc thiếu khuếch đại chỉ có một điểm đánh dấu cho vùng liên quan, nhưng việc mất đoạn tự chọn chỉ sY254 hoặc sY255 luôn luôn được coi là lỗi của phương pháp. Nếu chỉ có một điểm đánh dấu cho AZFa hoặc AZFb bị mất, trước tiên việc mất đoạn cần phải được xác nhận cẩn thận (xem bên dưới) và sau đó toàn bộ khu vực cần được nghiên cứu chi tiết hơn. Sự kiện này, tuy nhiên, hiện được coi là đặc biệt. Trong trường hợp mất đoạn AZFabc (tất cả tám điểm đánh dấu Yq đều vắng mặt), việc giải thích các dấu kiểm soát có tầm quan trọng vượt trội (SRY và ZFX / Y) để loại trừ các vấn đề kỹ thuật.
Các điều kiện PCR phải được tối ưu hóa cẩn thận trong từng phòng thí nghiệm theo thiết bị có sẵn (ví dụ: loại Máy điều nhiệt nhiệt) và chất lượng DNA. Nếu kết quả không rõ ràng hoặc nghi ngờ lỗi kỹ thuật, phản ứng đa mồi phải được lặp lại. Nếu phản ứng đa mồi không hoạt động đối với một mẫu DNA cụ thể, bộ mồi có thể được chạy trong các phản ứng đơn mồi. Nếu kết quả của cả hai phản ứng PCR đa mồi liên tục thể hiện sự mất đoạn, mất đoạn được xác nhận. Nếu kết quả của hai bộ ghép không khớp, toàn bộ bộ mồi nên được chạy lại trong PCR đơn, vì không có lý do gì để lặp lại PCR theo cách ban đầu. Người ta biết rằng PCR đơn ít khi khuếch đại thất bại và nên lặp lại khuếch đại ở nhiệt độ ủ thấp hơn. Không có lời khuyên nào về số lần lặp lại. Thử nghiệm phải được lặp lại cho đến khi kết quả rõ ràng và có thể tái thực hiện (thực hành tốt trong phòng thí nghiệm).
BÁO CÁO
Các báo cáo nên được viết theo định dạng chuẩn và phải dễ hiểu cho người không chuyên. Hướng dẫn về cách viết báo cáo về kết quả điều tra di truyền phân tử cho bệnh nhân có thể được tìm thấy tại trang web EMQN. Nói chung, các báo cáo phải rõ ràng, súc tích, chính xác, diễn giải đầy đủ, đáng tin cậy và có thẩm quyền. Báo cáo viết tay không được chấp nhận. Báo cáo phải bao gồm các thông tin sau:
- Thông tin của phòng thí nghiệm
- Ngày giới thiệu và báo cáo
- Thông tin bệnh nhân: tên đầy đủ, ngày sinh và ký hiệu số thứ tự của phòng thí nghiệm
- Một số dạng câu hỏi lâm sàng được hỏi (ví dụ: chẩn đoán vi mất đoạn nhiễm sắc thể Y) và chỉ định (ví dụ: azoospermia, ICSI, v.v.)
- Mô được nghiên cứu (ví dụ: máu,.., v.v.)
- Phương pháp được sử dụng (ví dụ: khuếch đại PCR đa mồi)
- Kết quả của phân tích: một dạng bảng của các locus STS khác nhau được phân tích được ưu tiên. Tránh sử dụng + và, có thể bị hiểu sai. Sử dụng các từ thay thế (ví dụ: xuất hiện/không xuất hiện hoặc tương tự)
- Một sự giải thích bằng văn bản có thể hiểu được bởi người không chuyên
- Chữ ký của hai giám định viên độc lập.
Ví dụ về các báo cáo liên quan đến việc mất đoạn thường xuyên nhất được cung cấp trong các tài liệu bổ sung.
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM VI MẤT ĐOẠN NST Y KHÁC
Kể từ khi xuất bản các hướng dẫn đầu tiên vào năm 1999, một số phương pháp thay thế đã xuất hiện để đánh giá mất đoạn nhiễm sắc thể Y. Ngoài ra, có các bộ dụng cụ thương mại trên thị trường, tuy nhiên, hầu như tất cả đều chứa một số lượng cao các marker không cần thiết (xem Phụ lục B). Điều này có thể dẫn đến việc phát hiện các mất đoạn sai, đặc biệt là khi chất lượng DNA và các điều kiện PCR là không tối ưu. Hơn nữa, phần lớn các bộ dụng cụ không cho phép xác nhận mất đoạn nghi ngờ bằng PCR đơn (xem tài liệu bổ sung). Gần đây, Vogt & Bender (2013) đã đề xuất một PCR đa mồi dựa trên các dấu hiệu đặc hiệu gen. Mặc dù phương pháp này cho phép phát hiện các loại bỏ đặc hiệu gen bị cô lập, nhưng độ hiếm cực kỳ và ý nghĩa lâm sàng không rõ ràng của các loại bỏ này đã loại trừ việc sử dụng nó trong chẩn đoán thông thường.
Các phương pháp thay thế dựa trên các giao thức hướng dẫn đã được phát triển bằng cách sử dụng điện di mao quản, real time PCR, MLPA và CGH. Sử dụng các bộ ghép EAA / EMQN, nhưng thêm huỳnh quang vào mồi, cho phép phát hiện bằng điện di mao quản. Một số phòng thí nghiệm đã điều chỉnh phương thức được đề xuất cho phù hợp và xác nhận điều này trong nhà (LH, giao tiếp cá nhân). Real time PCR có ưu điểm là tương đối nhanh, vì phương thức không liên quan đến việc chạy gel agarose, nhưng thiết bị cần thiết không có sẵn trong mọi phòng thí nghiệm. Có một báo cáo đã so sánh phát hiện mất đoạn NST Y bằng MLPA với các phương pháp khác, nhưng thật không may, chỉ có bản tóm tắt có sẵn bằng tiếng Anh. Cuối cùng, công nghệ microarray cũng đã được đề xuất như một thử nghiệm thay thế, nhưng nó dường như không hiệu quả về mặt chi phí và bao gồm nhiều điểm marker mức cần thiết.
Tóm lại, từ các tài liệu, không có bằng chứng nào cho thấy việc bổ sung nhiều hơn STS là tốt hơn cho chẩn đoán thường quy lâm sàng. Bất cứ khi nào phòng thí nghiệm thiết lập một phương pháp cụ thể, điều này cần được xác nhận trên một số lượng mẫu đủ lớn bao gồm các chứng dương và chứng âm để ước tính độ đặc hiệu và độ nhạy. Để báo cáo, điều quan trọng là phải đề cập cụ thể (các) phương pháp được sử dụng và không chỉ đề cập đến chúng như theo hướng dẫn, chỉ áp dụng cho phương pháp đa mồi với tất cả các điểm được mô tả trong tài liệu này.
HAI NĂM KINH NGHIỆM VỚI EAA/EMQN EQA
Các phòng thí nghiệm thực hiện chẩn đoán AZF hàng năm nên tham gia chương trình EQA. Một kế hoạch tương ứng có sẵn tại EMQN được thực hiện với sự cộng tác của EAA; đăng ký trực tuyến cho chương trình này có sẵn tại www.emqn.org. Trong mỗi sơ đồ AZF EAA/EMQN, ba mẫu DNA được xác thực với các mô tả trường hợp lâm sàng giả được phân phối cho các phòng thí nghiệm tham gia mỗi năm. Điều cơ bản là các mẫu DNA nhận được từ các nhà tổ chức chương trình EQA được xử lý chính xác giống như cách xử lý mẫu bệnh nhân, bao gồm cả báo cáo. Kết quả được đánh giá bởi ít nhất hai người đánh giá độc lập. Cả một báo cáo chung tóm tắt hiệu suất tổng thể và các vấn đề chung cũng như các báo cáo riêng lẻ cho từng người tham gia bao gồm các khuyến nghị cụ thể được đưa ra. Các phòng thí nghiệm nhận được một chứng chỉ trong đó hiệu suất của họ được đánh giá.
Từ năm 2000 đến 2012, số lượng phòng thí nghiệm tham gia gần như tăng gấp ba lần từ 57 đến 148 (Hình 4A). Tỷ lệ lỗi chẩn đoán (một kiểu gen không chính xác sẽ dẫn đến chẩn đoán sai) đã giảm mạnh trong 5 năm đầu tiên từ gần 8% và hiện dao động ở mức khoảng 1-2% (Hình 4B). Mặc dù có nhiều thay đổi, một đánh giá về chất lượng của nội dung báo cáo chẩn đoán cũng cho thấy sự gia tăng và khoảng 50% các phân tích trong 4 năm qua đã ghi được điểm đầy đủ, đây là một cải tiến rõ ràng trong thời gian trước đó của chương trình. Các vấn đề diễn giải lặp đi lặp lại vẫn phát sinh do các phòng thí nghiệm sử dụng số lượng điểm đánh dấu cao không cần thiết, được bao gồm cụ thể trong các bộ dụng cụ thương mại có sẵn (xem ở trên). Hai điểm số trong phiên dịch năm 2006 và 2012 (Hình 4B) có thể được giải thích bởi một người đàn ông 46, XX được coi là một trường hợp đặc biệt, dẫn đến các vấn đề tái diễn trong việc báo cáo các dấu hiệu tích cực, kết luận để thử nghiệm thêm (cần phải có kiểu chữ kary) và giá trị tiên lượng (không có cơ hội thành công của TESE).
Nhìn chung, chương trình EQA được thành lập là một công cụ thành công để cải thiện hiệu suất của các phòng thí nghiệm tham gia và đã chứng minh sự cải thiện về thực hành báo cáo và giảm tỷ lệ lỗi chẩn đoán.
TUYÊN BỐ
Những hướng dẫn này đã được thực hiện dựa trên kinh nghiệm lâu dài của các tác giả trong khung chương trình AZF kiểm soát chất lượng EAA / EMQN và phản ánh sự đồng thuận của một nhóm lớn các chuyên gia về di truyền vô sinh nam có mặt tại Florence-Utah- Hội thảo chuyên đề về ‘Di truyền vô sinh nam’. Tài liệu cũng đã được phê duyệt bởi hội đồng EMQN.
SỰ NHÌN NHẬN
Chúng tôi rất cảm ơn Tiến sĩ Sandra Kleiman và Tiến sĩ Helen Skaletsky vì những đóng góp quý báu của họ cho phiên họp bàn tròn của Hội nghị chuyên đề Florence-Utah. Chúng tôi cũng cảm ơn tất cả các chuyên gia tham dự phiên này vì sự tham gia tích cực của họ và sự hỗ trợ liên tục của Tiến sĩ Simon Patton và Outi Kamarainer tại EMQN.
Tags: azf, vô sinh nam
